وبلاگ

عصارهی گوشت[۵۱]۸عصارهی مخمر[۵۲]۴D(+)گلوکز۲۰دیپتاسیم فسفات۲پلیسوربات ۸۰۱تریآمونیوم سولفات۲استات سدیم۵سولفات منیزیم۲/۰سولفات منگنز۰۵/۰

– برای تهیهی یک لیتر از محیط کشت مایع، ۲/۵۲ گرم از محیط کشت به یک لیتر آب اضافه شد.
– به منظور تهیهی محیط کشت MRS جامد با ۵/۱ درصد آگار، ۱۵ گرم آگار – آگار به یک لیتر محیط کشت مایع اضافه شد.
-pH نهایی محیط کشت MRS مایع معادل ۲/۰±۶ است.
– محیط مانیتول آگار پایه
به منظور تهیه محیط کشت اختصاصی برای شمارش سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، اجزای تشکیل دهنده محیط کشت MRS (جدول ۲-۱) در یک لیتر از محیط کشت مایع، با یکدیگر مخلوط شده و به جای ۲۰ گرم در لیتر قند دکستروز، ۲۰ گرم در لیتر قند مانیتول در تهیه محیط کشت به کار رفت (سوکسی و همکاران). سپس با بهره گرفتن از اسید استیک گلایسیال (مرک آلمان) pH محیط کشت در ۲/۰±۶ تنظیم شد.
ب- مواد مورد استفاده جهت ریزپوشانی و پوششدهی باکتری پروبیوتیک و فرایند رهاسازی
– برای ریزپوشانی از صمغ فارسی[۵۳]، روغن کانولا (لادن، شرکت بهشهر، ایران) و امولسیفایرها شامل DATEM و PGPR90 استفاده شد.
– در آزمونهای رهایش از بافر فسفات استفاده شد و برای تهیهی آن از سدیم دیهیدروژن فسفات دو آبه و دیسدیم هیدروژن فسفات (مرک، آلمان) استفاده گردید.
ج- مواد مورد استفاده در تولید ماست پروبیوتیک
به منظور تهیهی ماست و برای حفظ یکنواختی نمونه های ماست طی انجام آزمایشها، از شیر خشک بدون چربی[۵۴] ساخت شرکت زرین سپاهان استفاده شد.
د- مواد مورد استفاده در ارزیابی مقاومت باکتری پروبیوتیک در برابر محیط شبیهسازی شده گوارشی
در آزمایشات مربوط به ارزیابی مقاومت باکتری نسبت به محیط شبیهسازی شده گوارشی از هیدروکسید سدیم (NaOH) و اسید هیدروکلریدریک (HCl) تولید شده توسط شرکت مرک آلمان، بایل بووین[۵۵] تولید شده توسط شرکت سیگما آلدریچ[۵۶] آلمان استفاده شد.
۳-۱-۳- میکروارگانیسم مورد استفاده
میکروارگانیسمهای مورد استفاده شامل باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی گروه علوم وصنایع غذایی دانشکده کشاورزی دانشگاه صنعتی و کشت های آغازگر در تولید ماست شامل لاکتوباسیلوسدلبروکی زیرگونه بولگاریکوس[۵۷] و استرپتوکوکوس ترموفیلوس[۵۸] تهیه شده از کریستین هانس دانمارک بودند.
۳-۲- عملیات و آزمونهای میکروبی
۳-۲-۱- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک
کشت خالص فریز شدهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، در محیط کشت حاوی ۱۵ درصد گلیسرول که در فریزر oC80- نگهداری میشد، از نمونه های استوک[۵۹] موجود در کلکسیون میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی ـ بیوتکنولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه صنعتی اصفهان تهیه شد. برای فعال سازی باکتری، میکروتیوب محتوی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، بعد از خارج کردن از فریز، در شرایط کاملا استریل و در کنار شعله، در دمای محیط قرارداده شد تا ذوب شود، سپس میکروتیوب به لولهای حاوی ۱۰ میلیلیتر از محیط کشتMRS استریل انتقال داده شد و در انکوباتور میکروآئروفیل (با ۵ درصد دی اکسیدکربن، دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۸ ساعت) گرمخانهگذاری شد. از این کشت روی سطح لام، گسترهی[۶۰] میکروبی تهیه شد و به منظور بررسی خصوصیات مورفولوژی باکتری، بوسیلهی میکروسکوپ نوری بررسی شد. پس از بررسیهای اولیه، سلولهای باکتری سه مرتبه و به صورت مداوم روی محیط MRS مایع و جامد کشت داده شدند. کشت ثانویه روی محیط کشت MRS جامد انجام شد و پلیتها در شرایط بیهوازی گرمخانهگذاری شدند. به منظور نگهداری کوتاه مدت، کلونیهای خالص تهیه شده بر روی محیط کشت MRS مورب[۶۱] کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری به یخچال با دمای ۴ درجه انتقال شد و ماهانه کشت مجدد انجام شد. به منظور نگهداری طولانی مدت، ۵۰۰ میکرولیتر از کشت مایع فعال به میکروتیوب حاوی ۵۰۰ میکرولیتر گلیسرول ۱۵درصد حجمی/ حجمی استریل خالص اضافه شد و بلافاصله در ازت مایع منجمد شد. این نمونه ها در فریزر ۸۰- نگهداری شدند. برای تهیهی کشت فعال در هر مرحله، کلونیهای خالص نگهداری شده در یخچال را در محیط MRS مایع تلقیح کرده و باکتریها به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه گرمخانه گذاری شدند.